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霍乱弧菌制备的材料与方法

【来源/作者】北纳创联 【更新日期】2015-08-19

一、概述

霍乱属于我国A类传染病,一般实验室不能保存霍乱弧菌,特别是产毒霍乱弧菌,因此在进行霍乱弧菌检测和分子生物学试验时,阳性对照是一个很大的问题。由于霍乱弧菌的相关毒力基因、管家基因和功能基因总是成簇的位于染色体上,一般都在几kh到几十kb之间,难以用一般的PcR方法扩增并克隆这些基因。基因组文库(genomlic library)是20世纪70年代末发展起来的一种分离基因组基因的新技术,它包含了基因组的全套遗传信息(即全部基因).人们可用相应的基因探针从文库中调取出任一特定的基因片段加以研究。目前宏观基因组学的应用己成为研究已有基因和寻找新基因及其产物的一条新途径,载体包括Cosmid、Fosmid和BAc等,平均插入片段大于40kb,Fosmid载体是一种替代cosmid载体构建大片段文库的新载体,与BAc文库构建相比,Fosmid文库稳定性好、随机性好、技术成熟、构建更简单快速。Fosmid载体由于插入了大肠埃希菌致育因子F因子,所以它在宿主菌中以单拷贝形式存在,稳定性好。并且载体上有一个可诱导的0riV高拷贝复制起始点,需要时可诱导达到高拷贝(50个左右)。另外,Fosmid文库随机性好,保证了每段DNA在文库中出现的频率均等。

为了解决霍乱弧菌hιyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因克隆质粒标准样品国内外均处于空白状况的现象,本研究主要针对霍乱弧菌hιyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因基因,用物理方法将霍乱弧菌全基因组DNA进行片段化处理,跑脉冲电泳后分离片段化的DNA.再将处理后的DNA片段连接到pCC1FOS载体上,电泳结束后切胶回收38 kb~48 kb之间的DNA片段,回收的DNA片段通过普通电泳和脉冲电泳确认,利用copycontrol Fosmid library productlon kit中的试剂盒提供的方法构建出霍乱弧菌基因片段Fosmid文库.然后用我们自有的专利技术即针对这四对基因的特异性引物和探针进行PCR扩增筛选hιyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因基因阳性克隆株,并对筛选得到的四种目的基因阳性质粒克隆菌株进行稳定性确认。

二、材料与方法

(一)菌株来源

制备霍乱弧菌O1血清型、霍乱弧菌O139血清型以及产毒霍乱弧菌所用标准菌株来源于美国标准菌种收藏所(American Type culture collection),霍乱弧菌O1血清型标准菌株号为ATCC 14033、霍乱弧菌O139血清型标准菌株号为ATCC 51394。霍乱弧菌标准菌株按照ISO/TS 21872-1进行菌株活化、划TSA平板培养基。

(二)主要仪器

1.脉冲场电泳仪:Bio-Rad(美国伯乐公司)。

2.凝胶成像仪:Bio-Rad(美国伯乐公司)。

3.Milli Q超纯水制备系统:Millpore。

4.电热恒温水浴器。

5.高压灭菌锅。

6.超低温冰箱:Thermo。

7.DYY一6B型电泳仪:上海六一仪器厂。

8.旋涡混合器。

(三)主要试剂

1.1×TE:取1mol/L Tris—HCl(pH8.O)10mL,0.5 mol/L EDTA(pH8.O)2 mL于1 L的容量瓶中,用双蒸水定容至1 L,高压灭菌室温保存。

2.氨苄青霉素(Amp+ ):用无菌水配制成100mg/ml母液,置一20℃冰箱保存。工作浓度100μg/mL。

3.LB液体培养基:1%蛋白胨,O.5%酵母提取物,1%NaCl.用NaOH调pH到7。2,121℃灭菌20 min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%~2%琼脂.灭菌后备用。

内蒙古快3走势图4.AxyPrep Easy-96质粒DNA试剂盒。

(四)试验步骤

1.霍乱弧菌垒基因组DNA的提取

从TSA培养基上刮取适量新鲜培养的霍乱弧菌菌体,均匀悬浊于细胞悬浊液(CSB)中,用BioMeⅢeux vitek C0l0nrneter测定菌浓度分别为4、6、8 三个OD值梯度,优化最优细胞悬浊液浓度。取400μL细菌悬浊液于相应的1.5mL离心管中,并加入置于45℃水浴中的400 μL的2%的低熔点琼脂糖,混匀后立即加入可制成胶块的一次性模具中.放在4℃凝固30min,取出胶块.置于10倍体积的ESP缓冲液(O.4 mol/L EDTA中含有终浓度为2%N-甲基甘氨酸钠盐和1mg /mL的蛋白酶K)中,50℃水浴中裂解48 h左右,其间24 h左右更换一次ESP缓冲液,裂解后观察胶块,呈透明状时可先切小块凝胶跑普通电泳观察裂解情况,如果电泳结果不理想继续放在50℃中裂解,裂解结束后用等体积的含有0.1 mmol/L PMSF的1×TE室温温浴2 h,再用1×TE洗涤包埋块两次,将包埋块保存于0.5 mol/L EDTA(pH8.0)中,4℃保存,此时.凝胶块中包含纯化的总基因组DNA。

2.C0pycontr0I F0smid文库的构建和保存

用物理方法将基因组DNA进行片段化处理,跑脉冲电泳后分离片段化的DNA.脉冲电泳条件为14℃,6 V/cm,脉冲1 s~10 s,16 h。电泳结束后切胶回收38 kb~48 kb之间的DNA片段.回收的DNA片段通过普通电泳和脉冲电泳确认,利用copycontrol Fosmid library production kit中的试剂补平粘性末端,再用平端化加磷试剂盒进行磷酸化处理,将处理后的DNA片段连到pcc1FOS载体上,4℃过夜,根据试剂盒提供的方法将连接液进行包装、转染、涂布平板.挑取阳性白色菌落保存在96孔板上,以每孔一个单克隆进行制作,37℃过夜培养,将培养后的板用含有30%甘油的IB培养基进行悬浮并移至新96孔板中,一70℃下贮存。

以每孔约100个单克隆的量进行96孔clon-pool板的制作,将LB平板上的克隆用灭菌牙签挑下.插入已经加入LB液体培养基(含有12.5 μg/mL青霉素)的}L板中,封膜,37℃过夜培养.将培养后的板用含有30%甘油的LB培养基进行悬浮并移至新96孔板中;同时在进行clon—p00l板培养时分别涂布相同菌量的两个LB(CIX)同体平板以确认96孔板中每孔起始培养克隆数。

存在96孔板巾的己构建好的霍乱弧菌Fosmid文库有960O个阳性克隆。

3.目的基因hιyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的筛选本试验的克隆菌是采用混板保存的,即大约每100个单克隆保存在一个96孔板的孔腔里,通过荧光PCR检测确定哪些孔腔中存在所要的目的基因。然后对检测阳性的孔腔再做纯化分离出所需要的单克隆菌株。

内蒙古快3走势图先取2 μ L~10 μ L甘油菌加入含有氯霉素的终浓度为12.5ng/μL的100μL LB培养基中,37℃1800r/min振荡过夜培养后,往培养液中添加500L 2YT(含有氯霉素的终浓度为12.5 ng/μL)1/1000量的诱导剂(1000×Induction),37℃1800r/min振荡培养5 h。使用试剂盒AxyPrep Easy-96质粒DNA试剂盒进行DNA提取,对提取的质粒DNA进行实时荧光PCR扩增,筛选出hιyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的单克隆菌株。

4.标准质粒库RM的构建

将筛选的所含目的基因的克隆菌株进行纯化,将具有相同目的基因的克隆菌株共同增菌培养,提取克隆质粒.用仪器检测所提取的质粒的浓度,浓度过低时可以进行真空蒸发浓缩.提取的质粒保存在TE溶液中.4℃保存。包含不同目的基因的质粒就构成了质粒标准库RM。

5.标准质粒库稳定性评价

使用筛选得到的四种目的基因阳性质粒克隆菌株,于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中,37℃200r/min下过夜培养。分别从过夜培养的菌液中吸取5μL接种于3 mL含氯霉素的2YT液体培养基中,37℃200r/min下过夜培养,重复以上步骤培养至第j天。提取第l天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的Fosmid DNA.进行普通电泳确认,经Not I酶切后进行琼脂糖脉冲电泳,检测克隆稳定性。

6.Fosmid文庠末端的测序

随机挑选8个克隆,提取Fosrlxid DNA进行双末端测序.以确定插入的DNA片段是否为霍乱弧菌.测序引物是pIBFP一1(5’GGATGTGcTGcAAGGCGATTAAG TTGG一3,)和pIBRIP-1(5’CTCGTATGTTG TGTGGAATTGTGAGC一3’)。测序仪器为ABI
PRISMTM 3730XL DNA Analyzer DNA分析仪.测序结果经BLAST进行比对。

内蒙古快3走势图(五)霍乱孤菌各基因实时PCR筛选方法的建立

1.各基因的PCR检测使用以下引物和探针

内蒙古快3走势图hlyA:正向引物:5’ GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3’;

内蒙古快3走势图反向引物:5’ ACTTCCACCCCACCAGTCA-3’

探针:5’NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3’

rfb-O1:正向引物:5’ -GCCCGTTTTGCATTATGGAT -3’

反向引物:5’-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3’

探针:5’FAM T(jATCCGACAAGcCCAAATGCCACTA(Eclipse) -3’

rfb一O139:正向引物:5’-AGT’FACCTGTTATGTACGATGAACC-3’

反向引物:5’ -CCATcAccAGAcAAGCATACAG-3’

探针:5’VIC TGCTCACGCCTCTCAAGTGCCTACG(Eclipse) -3’

ctxAB:正向引物:5’ CTCATCCAGAT(;AACAAGAAGTTTCTG -3’

反向引物:5’-CTATCTCTGTAGCCCCTATTACGATGT -3’

探针:5’FAM-AAGCCCCCAAAATGA(MGB)-3’

2.多重PCR反应体系

总体积20μL,包括步骤③制得的模板DNA溶液2 μL,2×PCR Taqman GEx酶预混液10μL,rfb-O1基因和ctxAB基因上下游引物各0.8μL、探针0.4μL.hlyA基因和rfb-O139基因上下游引物各0.4μL、探针0.2 μL,根据试验需要选择不同引物对和探针进行扩增实验.补充灭菌超纯水至总体积为20μL;其中引物和探针的浓度均为10μmol/L。

内蒙古快3走势图以上各组分加入至0.2 mL实时荧光PCR反应管中,混匀,5000 r/min,离心10s;上述反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测:

(1)95℃/10 min,1个循环;95℃/15 s,60℃/1 min,40个循环;

(2)每次循环的退火时收集荧光,检测结束后,根据扩增曲线和Ct值判定结果。

内蒙古快3走势图(3)Ct值≥40时,可判断该基因筛选结果为阴性;Ct值<40,可判断该基因筛选结果为阳性。

来源:北京标准物质网www.fudajzx.com


【关键词】霍乱弧菌 基因 北京标准物质网 

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